精子穿透去透明带金黄地鼠卵试验(sperm penetration of zone—free hamster egg test assay，SPA)。虽然目前还没有一种能全面、精确预见精子受精能力的检查，但精子穿透试验(sperm penetral：ion assay)是一种很有意义的预见精子受精能力的检查。我们知道受精过程是指精子进入卵子内并形成雄性原核。在适当的条件下，我们把人精子与去透明带金黄地鼠(1lamster)卵子混合，模仿进行这些过程：①因为这种精子的生物鉴定方法在临床被证明是有价值的，美国医学会的诊断和治疗技术评价(DATTA)小组认为去透明带金黄地鼠(hamster)卵精子穿透试验是用来评价精子受精潜能的最实用最可靠的方法。②临床使用这种无创检查的数据显示，该检查结果与男性使配偶妊娠高度关联。

    精子穿透去透明带金黄地鼠卵试验(sperm penetration of zone一：free hamster egg test assay，SPA)，该方法包括一系列实验过程，精子的洗涤和获能，去掉金黄地鼠卵子的透明带，用去掉透明带的金黄地鼠卵代替人卵做精子穿透试验。因为用容易获得的去掉透明带的金黄地鼠卵代替人卵，这使得该方法具有实际的应用价值。该方法突出的优点是：有足够的卵子，又无需男性患者的配偶参与，在检查的时间上也比较快。两个培养皿每个内放20个左右的去掉透明带金黄地鼠卵子与患者的精子一起培养观察受精的百分比，作为对照的是已生育过的自愿者的精液。

    判断精子的受精能力是根据卵子的受精率(受精的卵子占全部孵育的卵子的百分率)和受精指数(穿透卵子的精子总数与卵子总数之比)两个指标。正常生育男性的精子，对无透明带仓鼠卵细胞的穿透率，较生育力弱或不育者为高。sPA检测对判断人精子的受精能力及在体外受精的能力有很重要的参考价值，这一方法是目前公认的一项很有价值的精子功能试验，但操作过程复杂，对操作者技术要求高，因此难以普及应用。 

  (一)适应范围

    1．对男女方检查难以发现病因的不明原因的不育患者。

    2．作IuI、IvF等治疗前准备。

    3．男性不育患者经一阶段治疗后疗效的观察。

    4．有生育要求男性受到各种物理因素、化学因素及医疗因素(放疗、化疗)等有害刺激后，估计这些因素对他精子受精能力的影响，以及相关的科学研究作为一个观察的指标。

    (二)有关的试剂准备

    1．BWw培养液(以Biggers、’Whitten和Whittingham三者的首字母命名的培养液)，主要成分：每100ml含NaCl 0．554g、KCl 0．0356g、(2aCl2’2n20 0．025g、。KH2。P04 0．0162g、MgSO4·7H20 0．0294g、NaHC03 0．210g、NaPyr 0．003g、NalacO．370g、Glucose 0．100g、0．5％酚红1．Oml、青霉素10000Iu。

    2．精子获能液(上述的：BWw培养液中含有3．5％人血清白蛋白)，使用前再加入0．3％人血清白蛋白(加入人血清白蛋白后培养液只能保存二周)，配好后用微孔滤膜灭菌后使用。

    3．1．0g／L透明质酸酶，用前以．BWw液配制。

    4．1．0g／L胰蛋白酶，用前以BWw液配制。

 
(三)操作程序

    1．人精子的准备

    (1)精子收集：禁欲2～7天，用手淫法排精，收集于无菌容器内。精液液化后先进行精液常规检查，然后用1～3倍容积的BWw培养液稀释精液，洗涤精子，在425×g下离心5分钟，弃掉上清液，按此方法洗涤3次。

    (2)精子获能：将上述洗涤过的精子沉淀，用精子获能液1 rnl重新混悬。置培养箱中(37℃ 5％CO2，)培养4小时，使精子获能。最后用精子获能液调整精子密度，使之约为l×107／ml。

    2．去透明带金黄地鼠卵的准备

    (1)动物选择：选择性成熟年龄段的雌性金黄地鼠(8～12周龄)，通过观察阴道口分泌物了解l～2个性周期。

    (2)超排卵：当阴道口出现白色分泌物为周期第一天，当天上午腹腔注入20～50u孕马血清促性腺激素(J?MSG)，作超排卵。用PMSG 56小时后再注入人绒毛膜促性腺激素(hCG)30～50u诱发排卵。

    (3)卵子采集：注射16小时后处死动物，取出卵巢和输卵管伞端浸于BWw培养液中。在解剖镜下用解剖针刺破卵泡，冲洗卵泡腔，使附有卵丘的卵子进入BWw培养液内。每只超排卵的金黄地鼠约可获得50个左右的卵子。将带卵丘的卵子移至含有1．0g／L透明质酸酶的BWw培养液中，室温作用10分钟，吹打卵子，使卵丘细胞分散，再用BWw培养液洗去透明质酸酶溶液。

    (4)去除透明带：取上述无卵丘的卵子，放入含胰蛋白酶的BWw培养液，立即镜下观察，在胰蛋白酶的作用下，可见透明带在1分钟左右很快溶解。迅速用BWw培养液洗涤经酶消化去除透明带的卵子，以清除残留的胰蛋白酶，这一过程是实验中比较关键的步骤，应掌握好时间，否则难以得到合适的去透明带卵子。

    3．精子穿透试验(sperm penetration assayr)精卵授精：取无菌培养皿，在底部用精子获能液做成数个独立的液滴，上面覆盖已经处理好的液体石蜡，准备好的受精培养皿放置在37℃5％CO，培养箱中备用。

    取100肚l含有获能精子的获能液(精子密度为1×107／m1)，细心地加人受精培养皿的液滴中，再把去透明带的卵子移入液滴中，每滴中可放入20个左右的卵子，加盖置37℃5％C02中培养3小时，使精卵受精。

    吸出卵子，用BWw培养液洗3次以去掉粘附在卵子表面的附着物(一定要洗涤，否则附着在卵子上的精子对结果的判断有影响)。已受精的卵子先经低渗处理(低渗液为0．075mol／L氯化钾和1％枸橼酸钠以3：2比例混合)，细胞可适度膨胀便于观察。把卵子移到洁净玻片上，在盖玻片的周边涂抹上凡士林(目的是使卵子不破裂的情况下更清楚地观察卵细胞浆内肿大的精子头部)，轻轻覆盖上盖玻片，在相差显微镜下观察结果。也可采取固定染色后观察的方法，这样还可保留下标本。固定可使用乙醇(或甲醇)：冰醋酸(3：1)溶液，染色可用0．25％乙酰卡红或10％乙酰间苯二酚蓝染色，也可用吉姆萨染液染色。染色后观察的效果更好。

    (四)结果判断

    相差显微镜下可见受精卵胞浆内含有肿大的呈清亮区的精子头(一个卵可被多个精子穿透)，相对应的卵细胞膜上则附有精子尾(图20—2见彩色插图)。根据观察的结果计算出卵子受精率(又称精子穿透率)。

    (五)正常参考范围

    精子穿透去透明带金黄地鼠卵试验方法比较复杂，影响因素多，文献上关于卵子受精率的报道差距较大，有作者认为报道的卵子受精率往往低于实际的情况。比较公认的看法是，正常生育的男性SPA的卵子受精率不应该小于10％，因此卵子受精率<10％可认为是异常。关于生育男性精子受精指数最低标准为每卵穿透数应≥5，<5个精子说明生育力可能下降。有些不育男性SPA的卵子受精率也较高，但每卵穿透的精子数很少，因此计算精子受精指数也是必要的，卵子受精率和受精指数对患者受精能力的判断都是很有意义的指标。

    笔者的临床经验显示，SPA的卵子受精率得分大于或等于20％更易于妊娠。然而SPA得分低于20％分三种情况：在10％一19％之间，在l％-9％之间，为0。0分的精液，特别是复查仍为0分的无受精能力，除非在实验室做ICSI治疗。SPA有受精但得分低于正常者，自然的妊娠很困难，须给予改善精子质量的治疗或借助IuI、IvF、ICSI等治疗。在作IVF治疗过程中，如男性SPA的卵子受精率和受精指数异常，多数学者认为应直接选择为女方作ICSI治疗。目前SPA不仅用于男子不育的有关诊断，而且对于男性生育调节药物、环境污染、患者接受放疗或化疗治疗等有可能对精子功能产生影响的研究中也经常应用。

    (六)注意事项

    为了避免一些有可能对SPA结果有影响的因素，应设法使该试验条件标准化。就某一实验室而言，最好固定专人操作，对患者禁欲时间、标本从收集到处理的时间间隔、标本保存的温度等条件要求尽量一致；对实验动物的选择、动物的超排卵、精子洗涤、精子获能、授精过程等方法应统一；对有关的试剂应有质量控制方法。只有比较熟练掌握该方法后才能提供一个比较客观的实验结果。